توالی یک پپتید مهمترین فاکتور موثر بر فعالیت بیولوژیک آن است.توالی و ترکیب آمینواسیدی یک پپتید، همچنین بر نتیجه سنتز و خالص سازی و همینطور حلالیت آن نیز موثر است. برای یک پروژه پپتیدی موفق، فاکتورهای مانند سهولت سنتز با کمترین هزینه و امکان بکارگیری پپتید برای کاربردهای مختلف بر حسب پایداری و حلالیت آن مهم است.
اکثر پپتیدهای حال حاضر در بازار و تحقیقات بیولوژیکی از انتهای N، انتهای Cیا توالی میانی پروتئین‌های طبیعی مشتق شده اند. البته پپتیدها را می‌توانند بصورت de novo( از ابتدا) طراحی شوند. برای طراحی یک پپتید مناسب نکات بسیاری را باید رعایت کرد. در این مطلب همکاران ازمایشگاه بیوانفورماتیک پارس سیلیکو بخش های از پروتکل خود که در طراحی پپتید لحاظ می کنند را در اختیار عموم قرار داده اند:
این نکات می‌تواند به کاهش مشکلات معمول در طول سنتز، خالص سازی و به کارگیری پپتید کمک کند.
1. طول توالی پپتید: محدودیت طول توالی در حدود 10-15 باقی مانده برای افزایش بازده کلی، خلوص، به حداقل رساندن ناخالصی و کاهش قیمت مفید است. خلوص پپتیدهای سنتزی معمولا با افزایش طول توالی کاهش می‌یابد.
2. ساختمان دوم پپتید: بعضی پپتیدها ساختمان دوم از نوع صفحه بتا تشکیل می‌دهند. در طول سنتز تشکیل صفحه بتا به علت حلالیت ناقص پپتید در حال سنتز و تجمع آن سبب درجه بالای از حذف توالی در محصول نهایی می‌شود. برای جلوگیری از چنین موردی توالی های فاقد باقی مانده های متعدد و متوالی مانند والین، ایزولوسین، تیروزین، تریپتوفان، لوسین، گلایسین و ترئونین طراحی می شود. در صورتی که امکان چنین کاری نباشد، جایگزینی اسیدامینه صورت می گیرد و با قرار دادن گلایسین یا پرولین در هر سه باقی مانده انجام شود و یا جایگزینی گلایسین با آسپارژین و جایگزینی ترئونین با سرین.
3. تمایل باقیمانده‌ها برای اکسیداسیون: پپتیدهای حاوی چندین باقیمانده Cys، Met یا Trp تمایل به اکسیداسیون داشته و واکنش‌های جانبی اثر منفی بر حلالیت و خلوص پپتید دارد. جلوگیری یا به حداقل رساندن چنین باقیمانده های در توالی یا جایگزینی با باقیماندهای جایگزین مشابه می‌تواند مفید واقع شود. بطور مثال نورلوسین می‌تواند به عنوان جایگزین برای Met ، و سرین یک جایگزین کمتر واکنش پذیر برای Cys است.
4. ترکیب آمینواسیدی: ترکیب کلی آمینواسیدی یک پپتید اغلب در طول طراحی نادیده گرفته می‌شود. این ترکیب بر حلالیت نهایی، سنتز پپتید و خالص سازی تاثیر خواهد گذاشت. حفظ مقدار آمینواسیدهای آبگریز (Leu، Val، Ile، Met، Phe، Trp و غیره) زیر 50 درصد و اطمینان از وجود حداقل یک اسید آمینه باردار به ازای هر 5 آمینواسید. جایگزینی Ala با Gly یا اضافه کردن باقیمانده های قطبی (چندین آرژنین، لایزین و PEG کوچک) به انتهای N و C حلالیت را بهبود می‌بخشد.
5. آمیداسیون و کلاهک گذاری: برای توالیهای درونی مشتق از پروتئین‌های طبیعی کلاهک برای انتهای N و C یا هر دو به منظور جلوگیری از باردار بودن که در توالی طبیعی وجود ندارد. انتهای C و N می‌توانند به صورت گروه آمیدی یا استیل به ترتیب بلوکه شوند.
6. ترکیب آمینواسیدهای انتهای N: از قرار دادن گلوتامین در انتهای N اجتناب شود زیرا گلوتامین تحت شرایط اسیدی به پیروگلوتامات کاتالیز می‌شود. در صورتی که لازم است گلوتاماین در این موقعیت باشد یک گروه استیل به گروه آمینو گلوتامین اضافه کرده یا از پیروگلوتامات به جای آن در توالی استفاده شود. اجتناب از آسپارژین در انتهای N برای جلوگیری از ایجاد مشکل در طول برداشت گروه محافظ بعد از سنتز.
7. ترکیب آمینواسید در انتهای C: آمینواسیدهای مانند سیستئین، پرولین و گلایسین باید در انتهای C به علت موارد مختلفی مانند راسمیزاسیون، تشکیل دی پپتید، تشکیل دی کتوپیپرازین و ... قرار داده نشوند. اگرچه امروزه روشهای سنتزی برای جلوگیری از چنین مشکلاتی وجود دارد. در صورتیکه یک اسیدآمینه غیرمعمول مانند D-آمینواسیدها در انتهای C وجود داشته باشد اضافه کردن گروه آمیدی در انتهای C توصیه می‌شود. اگر مدیفیکاسیونی (مانند بیوتین، فلورسین) در انتهای C وجود داشته باشد ترجیحا باید توسط زنجیره جانبی لایزین متصل شود.
8. آمینواسیدهای مشکل ساز: از تعداد متعددی از آمینواسیدهای شامل پرولین (ایزومریزاسیون سیس و ترانس)، آسپارتیک اسید (تشکیل آسپارتیماید)، گلاسین (پیوند هیدروژنی و تشکیل ژل) و سرین (مشکل جفت شدن) باید در توالی اجتناب شود. همچنین نباید بیش از 10 آمینواسید بعد از فسفوآمینواسید از سمت انتهای C قرار گیرد.
9. اتصال لیگاند: اتصال یک فاصله دهنده (spacer) بین پپتید و لیگاند بزرگ برای به حداقل رساندن تاثیر لیگاند بر تاخوردگی پپتید.
10. حلالیت: در طول طراحی توالی توجه به حلالیت پپتید با احتساب تعدادی از اسیدهای آمینه باردار در پپتید از جمله انتهای N و C غیربلوکه. معمولا حداقل یک بار برای هر 5 اسیدآمینه حلالیت را بهبود می‌دهد. اطمینان از وجود نداشتن امتداد طولانی (بیش از 5 آمینواسید) از باقیماندهای بدون بار. توالی کوتاهی با باقیماندهای بسیار آبدوست باعث مشکلاتی در طی خالص سازی شده بطوریکه ممکن است روی ستون HPLC بخوبی حفظ نشود.
de novo